I. YÊU CẦU CẦN ĐẠT

Thực hành tách chiết được DNA từ các mẫu vật sống.

II. CHUẨN BỊ

1. Dụng cụ, thiết bị

• Chày, cối sứ hoặc máy xay thịt, máy nghiền mẫu vật sống.

• Ống nghiệm thuỷ tinh, giá đỡ ống nghiệm, giấy lọc và phễu lọc.

• Tăm tre dài hoặc que tre tròn hay que thuỷ tinh.

2. Nguyên liệu, hóa chất

• Gan gà hoặc mô động vật, thực vật tươi sống bất kì. Tuỳ điều kiện thực tế để lựa chọn mẫu vật cho phù hợp.

• Dứa tươi: 1/4 quả.

• Nước rửa chén bát hoặc dung dịch tẩy rửa: 500 mL

• Cồn ethanol lạnh (70 – 95%): 500 mL.

III. NGUYÊN LÝ VÀ CÁCH TIẾN HÀNH

Quy trình dưới đây mô tả các bước tách chiết DNA với mẫu vật là gan gà.

• Bước 1: Nghiền khoảng 5 g gan gà, cho thêm khoảng 150 mL nước lạnh vào, khuấy đều. Lấy 1/4 quả dứa đã gọt vỏ, ép lấy nước đổ vào một ống nghiệm.

• Bước 2: Lọc dung dịch qua phễu lọc, chỉ lấy dịch nước trong.

• Bước 3: Cho dịch lọc vào trong một ống nghiệm khác cùng với 30 mL nước rửa bát pha loãng, khuấy đều, sau đó để yên khoảng 5 – 10 phút.

• Bước 4: Rót hỗn hợp từ bước 3 sang ống nghiệm mới với thể tích dịch khoảng 1/3 đến 1/2 ống nghiệm; bổ sung 5 mL nước dứa tươi vào ống nghiệm và khuấy nhẹ rồi để yên trong khoảng 10 phút.

• Bước 5: Ống nghiệm lấy từ bước 4 được đổ thêm cồn ethanol. Sau ít phút, DNA được kết tủa sẽ nổi lên ở lớp cần phía trên ống nghiệm. Dùng tăm tre hoặc đũa thuỷ tinh quấn lấy DNA và đưa ra khỏi ống nghiệm.

IV. THU HOẠCH

BÁO CÁO THỰC HÀNH

1. Mục đích

Thực hành tách chiết được DNA từ các mẫu vật sống.

2. Kết quả và giải thích

• Kết quả: Thu được kết tủa DNA màu trắng.

• Giải thích:

• Do DNA tồn tại trong nhân tế bào nên để tách chiết được DNA ra khỏi tế bào, cần phá vỡ mô để tách rời các tế bào và phá huỷ thành tế bào bằng việc nghiền mẫu vật; phá huỷ màng tế bào, màng nhân bằng các dung dịch tẩy rửa hoà tan lipid.

• Trong tế bào, DNA liên kết với nhiều protein nên cần loại bỏ các protein bằng enzyme phân giải protein là protease (có trong nước ép dứa tươi), dung dịch lúc này chỉ còn DNA và RNA.

• Để tách DNA ra khỏi dung dịch chiết xuất, cần kết tủa DNA bằng ethanol.

• Vì ethanol nhẹ hơn nước, nên ethanol sẽ nổi lên trên cùng với DNA kết tủa.

3. Trả lời câu hỏi

Câu 1: Tại sao phải sử dụng dung dịch nước rửa chén bát hay dung dịch tẩy rửa?

Giải chi tiết:

Do DNA tồn tại trong nhân tế bào nên để tách chiết được DNA ra khỏi tế bào, cần phá vỡ mô để tách rời các tế bào và phá huỷ thành tế bào và phá huỷ màng tế bào, màng nhân bằng các dung dịch tẩy rửa hoà tan lipid nhằm giải phóng dịch nhân tế bào vào dung dịch chiết xuất.

Câu 2: Tại sao cần sử dụng nước dứa? Có thể thay nước dứa bằng dung dịch gì?

Giải chi tiết:

• Trong tế bào, DNA liên kết với nhiều protein (như histone, các protein điều hoà và phiên mã), nên cần loại bỏ các protein bằng enzyme phân giải protein là protease (có trong nước ép dứa tươi) để phân cắt chuỗi polypeptide thành các amino acid đơn phân hoặc đoạn peptide nhỏ, lúc đó dung dịch sẽ chỉ còn các đại phân tử DNA và RNA.

• Có thể thay thế nước dứa bằng một số dung dịch khác như dung dịch EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), dung dịch PBS (phosphate-buffered saline), hoặc dung dịch Tris - HCl (tris(hydroxymethyl) aminomethane - hydrochloride). Tuy nhiên, mỗi dung dịch có ảnh hưởng khác nhau đối với quá trình tách chiết DNA và cần được lựa chọn dựa trên mục đích cụ thể của thí nghiệm.

Câu 3: Tại sao cần sử dụng cồn ethanol?

Giải chi tiết:

• Do ethanol có ái lực với nước mạnh hơn với DNA nên khi cho cồn ethanol vào dịch chiết chứa DNA thì các phân tử DNA có xu hướng bị đầy sát lại gần nhau và kết tụ lại với nhau dưới dạng vật chất có màu trắng dục.

• Vì ethanol nhẹ hơn nước, nên khi cho ethanol vào phía trên dịch chiết tế bào sẽ tách thành lớp trong suốt trong ống nghiệm phía bên trên, lúc này DNA sẽ đi từ dịch chiết tế bào lên và bị kết tủa dưới dạng vật chất có màu trắng đục.

Câu 4: Cần phải cải tiến, khắc phục điều gì để thu được kết quả tốt hơn?

Giải chi tiết:

Cần lưu ý các điểm sau để thu được kết quả tốt hơn:

• Đeo bao tay và mặc đồ bảo hộ cẩn thận do DNA rất dễ bị nhiễm gây ra các sai sót cho các thí nghiệm tiếp theo.

• Chọn lựa mẫu vật tốt, lưu trữ và xử lý đúng cách trước khi bắt đầu quá trình tách chiết.

• Khi nghiền mẫu cần phải nghiền kỹ, đảm bảo các mô và thành tế bào đều bị phá vỡ.

• Lựa chọn dung dịch tách chiết phù hợp với loại mẫu và ứng dụng cụ thể.

• Sau khi tách chiết DNA, thực hiện các bước làm sạch để loại bỏ tạp chất (protein, RNA) có thể ảnh hưởng đến thí nghiệm tiếp theo.

• Kiểm tra và đánh giá hiệu suất tách chiết bằng cách sử dụng các phương pháp như đo OD, điện di trên gel agarose, PCR,...